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蘑菇培菌室,出菇室(一)母种的分离培养 食用菌母种的分离,可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法 孢子分离法,是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝,培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强,但孢子个体之间有差异,且自然分化现象较严重,变异大,需经出菇试验才能在生产上应用。 (l)单孢分离法:是每次或每支试管只取一个担孢子, 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝,有结实能力,可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用,而且技术复杂,一般采用多孢分离法。 (2)多孢分离法:就是把许多孢子接种在同一培养基上,让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法,有以下几种: ①种菇孢子弹射法:选择个体健壮、朵形圆正,无病虫害、出菇均匀、高产稳产,适应性强的八九分成熟的种菇,切去大部分,菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内,把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面,漏斗倒盖在培养皿上面;上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上,静置12~20小时,菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印(平菇极淡紫色,蘑菇、草菇 为褐色,香菇、金针菇孢子印白色)。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发,生成菌落时,选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。 还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后,按上述程序,轻轻掀开玻璃钟罩,将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上,放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩,用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。 ②褶上涂抹法:按无菌操作分离时;应选择成熟的种菇,用接种针直接插入褶片之间,轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子,再在培养基上划线接种。 ③钩悬法:取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕,用无菌不锈钢丝(或铁丝、棉线等其他悬挂材料)悬挂于三角瓶内的培养基的上方,勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。 ④贴附法:按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块, 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6~12小时的培养,待孢子落在斜面上,立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。 孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮,当母种定植一星期左右,菌丝布满斜面时,选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管,进而转管扩大,一般到栽培种,转管不宜超过5次。 孢子分离得到的母种,必须通过出菇试验,鉴定为优质菌种后,才可供生产使用。 一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等,都可用多孢分离法获得母种。 现就银耳孢子分离略述于下: 按无菌操作获取种耳后,悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后,瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳,置 20℃—25℃温箱培养2~3天,培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落,就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上,待长满斜面后,再移接入营养丰富,且表面比较干燥的培养基上。经30天左右,菌落长出白色菌丝。 银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌(香灰菌丝)混合培养时,由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质,提供营养,才能利于银耳孢子萌发,菌丝的定植和子实体的形成。 在两种菌丝交会时,先选出两种纯菌丝。 羽毛状菌丝要纯化选育,一般要选取生长迅速,爬壁力强的试管斜面或种瓶,取先端菌丝,转管移接,置25℃—28℃上培养,重复转管几次即可得到优良纯种。 银耳菌丝的特点,菌丝生长缓慢,担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时,先取经8~IO天培养的银耳菌丝斜面,按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一 小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。 2.组织分离培养法 利用子实体内部组织,进行无性繁殖而获得母种的简便方法,即组织分离。该法操作简便,菌丝生长发育快,品种特性易保存下来,特别是杂交育种后,优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。 (l)子实体分离:种菇要选朵大盖厚,柄短,八九分成熟的优良品种。切去菇两基部,在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟,再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次,进行表面消毒。接种时,只要将种菇撕开,在萌盖和菌柄交界处或菌褶处,挑取一小块组织;移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天,就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝,转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。 (2)菌核分离:茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离,同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净,用酒精或升汞消毒后,切开菌核,取中间组织一小块,约黄豆大小,接种在PDA 培养基斜面上,保温培养。应注意的是,菌核是贮藏器官,大部分是多糖类物质,只含有少量的菌丝,因此挑取的组织块要大一些,如果组织块过小,则不易分出菌种。 (3)菌素分离:有一部分子实体不易找到,也没有菌核,可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2~3次, 然后去掉黑色外皮层(菌鞘),抽出白色菌髓部分;用无菌剪刀将菌髓剪一小段,接种在培养基上,保温培养,即得该菌菌种。 菌素分离要注意:因菌素比较细小,分离素也比较细小,分离时极易污染杂菌,所以要严格操作。 3.基内菌丝分离培养法 利用食用菌生育的基质作为分离材料,来得到纯菌种的一种方法,叫基内菌丝分离法。 此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现,而且是朝生暮死,不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是,干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此,有必要保留较长的时间(约1个月),以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为,材中菌丝分离(即菇木或耳木分离法)及土中菌丝分离法等。 (1)材中菌丝分离法:就是菇木或耳木分离法,为了减少杂菌的感染,菇(耳)木在分离之前,必须进行无菌处理。可以把菇(耳)水表面用酒精灯火焰轻轻烧过,以烧死霉菌的孢子,或再用0.1%的升汞水浸孢几分钟,然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以,菌丝生长缓慢的种类应浅取;菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇(耳)木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些,以减少杂菌感染机会,提离菌种的纯度。接种块移到培养基上,就应该放到适合菌丝生长的22℃~26℃ 的温室或温箱中培养,使菌丝恢复生长。 (2)土中菌丝分离:食用菌种类很多,许多土生的食用菌;孢子不易萌发。组织分离也不易成功,用土中菌丝分离获得纯种的方法,叫土中菌丝分离。 土中菌丝分离时要注意,由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物,因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰,尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种,反复用无菌水冲洗,在培养基中加入一些抑制细菌 生长的药物,如 40微克/升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌,可以把菌落边缘的菌丝挑出来,接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力,因此在木屑培养基中不易扩展;只局限于接种处。待菌丝长出感染区后,就可以再进行扩大提纯了。 (3)子实体基部分离:从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法,叫子实体基部分离,现以袋栽银耳为例说明: 从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中;选择生活力最强的幼耳5袋,移到气候温和,有散射光的野外场所进行后期培养,以增强菌丝体的生活力。经培养7~10天后,待子实体直径达4~5厘米时便可取回,作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵,用利刀割掉银耳子实体,放置于 0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜,以便杀死瓶中的害虫。然后用75%酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质,连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后,用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除,并进行培养。待袋口露出白色菌丝时,用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体,迅速移入母种试管培养基的中央,轻轻地脱去接种针, 塞上棉塞。 为了能够获得较多的母种,一次接种量要有100—200支试管,以便从中选择。分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多,菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后,分离物的边缘就可看 到白色菌丝。每天要至少观察两次,以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温培养10-15天后,当接种块扭结团出现红、黄色水珠时,即可扩大原种。 (二)原种和栽培种的接种培养 母种获得以后,为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。 原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。 瓶装或袋装的原种培养基灭菌后,可送入灭过菌的接种箱内,待瓶中的培养基冷至30℃以下,可按照无菌操作程序进行接种。 菌种瓶(袋)放入培养室时,要经常进行检查,一经发现杂菌污染,立即取出。培养成的原种,菌丝体必须健壮有力,紧贴瓶壁而不干缩,颜色纯正,具有一定清香味,生活力强,扩制成栽培种时吃料快。 栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种,它和原种的接种及培养相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。蘑菇多用粪草做培养料。 栽培种要求料块不脱水干缩。菌丝体健壮有力、颜色纯正,有清香味,无老化现象,无杂菌污染,有的种许可有少量原基,接入栽培料后,发菌快,长势好,生活力强。 原种在接栽培种时,原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。 (三)液体种的简单培养 目前,用液体深层发酵法生产菌种,具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点,是实现食用菌工厂化生产的目标。现将液体种培育过程简述于后,供参考。 简言之就是将纯正优良的菌种,接入液体培养基(固体培养基不加凝固剂),使菌丝繁殖形成大量小菌球,然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内,制成菌块、培养其形成子实体。还可用于制原种、栽培种。 培养液体菌种,可将培养液装入三角瓶中,约占空瓶的五分之一重量。用摇瓶机(也称摇床)来培养。摇瓶机有旋转式和往复式两种,一般多用往复式。液体培养基可用马铃薯汁(加糖),麦芽汁配制,也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。可以混合培养基,因适用于多种食用菌和药用菌的培养,均有好效果。组分:豆饼粉2%,玉米粉1%, 葡萄糖3%,酵母粉0.5%,磷酸二氢钾0.1%,碳酸钙 0.2%, pH自然, 12℃灭菌半小时。然后接种培养。 如果生产量较大,在三角瓶的基础上,再逐级扩大种子缸,发酵罐中进行液体深层通气发酵,产生大量菌种。但由于生产中要求设备繁多,技术性强,我们还应创造条件;实现食用菌栽培的现代化。 (四)菌种质量的鉴定 菌种质量鉴定最好的方法是,做出菇试验。但是时间比较长。在购置菌种时,或在菌种生产中,如何能知菌丝生长情况,快速判断菌种质量?我们介绍几种方法: 1.肉眼观察:优良菌种菌丝浓白,绒状,粗壮密集,生长整齐,速度快,香味浓厚。 2.优良菌种标准可归纳为:"纯、香、正、壮、润"五个字。检查时,打开瓶塞,从菌种瓶中部取出小块菌丝体,观察色泽,闻其气味,手捏料块检查其含水量,看是否符合上述要求标准。 3.显微镜检查:挑取少量菌丝,置显微镜上观察其形态,菌丝分枝,分隔情况,锁状联合,细胞膜的厚薄。 培养观察:从菌种瓶中挑取小块菌丝体,接种斜面试管培养基上,置23℃~25℃恒温中培养,经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快,旺盛纯一,健壮浓厚,长且整齐,则表示菌种的生活力强。 4.分块法:在桌上放一张白纸,把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块,用手分成2块,再把2块分成4块,4块 分成8块,依次进行。优良菌种整块多,碎渣少。劣次菌整块少,碎渣多。 5.液体菌种鉴别:当三角瓶或发酵缸培养3-7天后,如液面出现气泡,产生"油皮"、混浊等现象,说明菌种本 身带有杂菌。如菌块上浮,或迟迟长出很薄的菌丝层,则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状,表明菌种生命力强。 (五)菌种生产过程中的杂茵防治 在生产菌种时,要时刻注意杂菌污染,以防为主,一旦发生,根治很不容易。所以整个制种过程都必须在无菌条件下进行。接种箱及所有分离、接种的用具、器皿,都要进行严格的消毒灭菌。工作人员的双手要用消毒剂清洗,并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩,动作要敏捷、准确,尽量不要讲话走动,以防空气中的杂菌感染。 分离母种时,选择出菇早、生活力强,第一潮菇是关键,因它生活力强,接种后迅速占领阵地,无杂菌侵入的机会。 被污染的菌种,原因是多方面的,一般是灭菌不彻底所致,或因接种时无菌操作不严、瓶盖不合适造成的。所以灭菌一定要彻底,最好在接种萌将培养基置25℃左右温箱中做效果检查,经2天不长杂菌,说明彻底,可以使用,接种过程中一定要严格无菌操作。 污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌,因种菇表面带菌,消毒不彻底,通过组织块将杂菌带入培养基。 总之,污染机会很多,要注意环境消毒,按无菌操作规程彻底灭菌,层层把关,环环抓紧,严加注意;提离菌种质量。
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